1898 im Schloss Hartheim die so genannte "Anstalt für Schwach- und Blödsinnige, Idioten und Cretinöse" eingerichtet.
Im Frühjahr 1940 führte man innerhalb weniger Wochen Umbauarbeiten hinsichtlich einer Adaption des Schlosses zu einer Euthanasie-Anstalt durch; die Bewohner wurden zu diesem Zeitpunkt auf andere Pflegeanstalten im Gau Oberdonau verteilt. Sie sollten zu den ersten Opfern der Tötungsanstalt Hartheim werden.
Der erste Transport erreichte Hartheim am 20. Mai 1940. Zwischen 1940 und 1944 wurden im Schloss Hartheim rund 30.000 Menschen mit körperlicher und geistiger Behinderung sowie psychisch kranke Menschen ermordet. Sie waren teils Patienten aus psychiatrischen Anstalten und Bewohner von Behinderteneinrichtungen und Fürsorgeheimen, teils Häftlinge aus den KZ Mauthausen, Gusen und Dachau sowie ZwangsarbeiterInnen.
Hartheim stand unter der medizinischen Leitung des Linzer Psychiaters Dr. Rudolf Lonauer. In seinen Kompetenzbereich fielen die Tötung der Opfer, die Bestimmung der Todesursache, die Führung der Krankenakten und die Vertretung der "Landesanstalt Hartheim" nach außen. Rudolf Lonauer war auch ärztlicher Direktor der Gau-Heil- und Pflegeanstalt Niedernhart in Linz. Diese fungierte als Zwischenstation für Opfer auf dem Weg nach Hartheim. Stellvertretender medizinischer Leiter war Dr. Georg Renno.
Verwaltungstechnischer Leiter der Tötungsanstalt Hartheim war Christian Wirth, ein Polizeioffizier aus Württemberg, der bereits in den NS-Euthanasieanstalten Grafeneck und Hadamar gearbeitet hatte. Er war in seiner Funktion als "Büroleiter" Vorstand des Sonderstandesamtes, welches in Hartheim eingerichtet worden war. Außerdem oblagen ihm die Führung des Urnenbuches und des Urnenversands, ortspolizeiliche Aufgaben, sowie der Schriftverkehr mit den "Abgabeanstalten".
Insgesamt waren ca. 60–70 Personen in der Tötungsanstalt Hartheim beschäftigt. Neben den Pflegern, die auch den meisten Kontakt mit den Opfern hatten und diese zumeist bereits in den Bussen begleiteten, stellten die Angestellten, die im administrativen Bereich für das Ausstellen und den Versand der Beileidsschreiben und Todesurkunden, sowie den Versand der Urnen zuständig waren, den überwiegenden Teil der Belegschaft dar, welche zum Großteil im Schloss wohnte. Als Ausflugsziel stand der Belegschaft von Hartheim das Haus Schoberstein in Weißenbach am Attersee zur Verfügung. Ebenso wurden als Ausgleich für die Belegschaft des Schlosses abendliche Feste und gemeinsame Ausflüge organisiert – oftmals mit den KollegInnen aus dem Konzentrationslager Mauthausen.
Im Sonderstandesamt Hartheim, welches im Schloss untergebracht war, stellte man die Todesurkunden aus. Auf diesen Dokumenten wurden hinsichtlich Todesursache, Todestag und Todesort gezielt falsche Angaben gemacht, um die Angehörigen auf eine falsche Spur zu führen und Nachforschungen zu erschweren. Als Todesursache gab man dabei gerne "Lungentuberkulose" an, da es sich um eine ansteckende Krankheit handelte, die es bedingte, den Leichnam sofort zu verbrennen.